Penicylina jest antybiotykiem bakteriobójczym aktywnym wobec wielu bakterii. Stosuje się ją w zapaleniu migdałków podniebiennych, zakażeniach dróg oddechowych, w leczeniu ostrej choroby reumatycznej, róży, płonicy (szkarlatyny), rzeżączki i innych zakażeń powodowanych przez bakterie wrażliwe na lek. Ponadto razem z innymi antybiotykami w leczeniu zapaleń opon mózgowo-rdzeniowych, zakażeniach stawów i kości, wągliku, promienicy i kile. U dzieci i młodzieży stosuje się ją niemal wyłącznie w zapobieganiu chorobie reumatycznej i zapaleniu wsierdzia. Penicylina prokainowa działa dłużej niż penicylina krystaliczna, lecz ma również dodatkowe działania niepożądane związane z zawartością prokainy.